詳細描述巨噬細胞原代培養(yǎng)中細胞分離與培養(yǎng)的具體步驟
2024-10-24 11:02:17
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
巨噬細胞原代培養(yǎng)中細胞分離與培養(yǎng)的具體步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，普拉特澤生物細胞實驗平臺專業(yè)承接細胞誘導/分化外包、細胞焦亡等細胞實驗代做服務，積累專業(yè)豐富的實驗操作經(jīng)驗。
在巨噬細胞原代培養(yǎng)中，細胞分離與培養(yǎng)的具體步驟可以細分為以下幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以下是根據(jù)權(quán)威來源整理的詳細步驟：
一、實驗準備
?1. 實驗動物與試劑?
①選擇合適的實驗動物，如SPF級小鼠，體質(zhì)量通常在18～22g，雄性，6～8周齡。
②準備必要的試劑，包括細胞培養(yǎng)基（如RPMI 1640）、胎牛血清（FBS）、雙抗（抗生素和抗真菌劑）、紅細胞裂解液、PBS（磷酸鹽緩沖液）、以及用于誘導巨噬細胞分化的細胞因子，如M-CSF（巨噬細胞集落刺激因子）。
?2. 實驗器械?
一次性注射器、手術(shù)器械（如眼科剪、眼科鑷）、離心管、細胞培養(yǎng)皿、移液槍及槍頭等，并確保所有金屬器械經(jīng)過高壓滅菌，離心管輻照消毒。
二、細胞分離
腹腔巨噬細胞分離
?1. 腹腔注射刺激物?
在實驗前三天，每天給小鼠腹腔注射1mL的3%巰基乙酸鹽肉湯，以刺激巨噬細胞增殖。
?2. 處死小鼠并收集腹腔液?
⑴采用脫頸法處死小鼠，將小鼠浸泡在75%乙醇中滅菌3-5分鐘，然后移至超凈工作臺。
⑵用預冷的PBS或細胞培養(yǎng)基沖洗腹腔，輕輕按摩小鼠腹部數(shù)次，使液體在腹腔內(nèi)充分流動。
⑶抽取腹腔液，收集至離心管中，并重復沖洗腹腔以增加細胞收集量。
?3. 細胞分離與純化?
⑴將收集的腹腔灌洗液在常溫條件下以1000rpm/min離心10分鐘，棄去上清。
⑵用細胞培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，并進行細胞計數(shù)。
⑶將細胞懸液接種至細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2～3小時，使巨噬細胞貼壁。
⑷棄去未貼壁的細胞，余下的貼壁細胞即為腹腔巨噬細胞。
骨髓巨噬細胞分離
?1. 提取骨髓細胞?
①處死小鼠后，用剪刀和鑷子取出其雙側(cè)股骨和脛骨，剔除附著的肌肉和組織。
②將骨骼浸泡在75%乙醇中滅菌后，用冷的PBS清洗。
③使用注射器吸取含有M-CSF的誘導培養(yǎng)基，反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸液。
?2. 細胞培養(yǎng)與誘導分化?
①將骨髓細胞懸液過篩后離心，去除紅細胞和雜質(zhì)。
②用含有M-CSF的誘導培養(yǎng)基重懸細胞，并接種至細胞培養(yǎng)皿中。
③在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換新鮮培養(yǎng)基。
④培養(yǎng)7天后，收集貼壁的骨髓巨噬細胞用于后續(xù)實驗。
三、細胞培養(yǎng)
?1. 細胞貼壁與換液?
巨噬細胞貼壁后，需定期更換新鮮的培養(yǎng)基以維持細胞生長環(huán)境。
每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，并在更換前用PBS清洗細胞以去除死細胞和雜質(zhì)。
?2. 細胞形態(tài)觀察?
使用倒置顯微鏡定期觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)。
巨噬細胞通常呈規(guī)則圓形或不規(guī)則形狀，貼壁較快且具有較強的吞噬能力。
?3. 細胞計數(shù)與活性檢測?
⑴使用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，并計算細胞活性。
⑵細胞活性檢測通常使用臺盼藍染色法，通過計算活細胞與總細胞的比例來評估細胞活性。
通過以上步驟，可以成功分離并培養(yǎng)出高質(zhì)量的巨噬細胞原代細胞，為后續(xù)的實驗研究提供可靠的細胞來源。
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