基因表達調(diào)控及相關(guān)元件介紹及下載

高中階段我們學(xué)過中心法則，中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的傳遞過程。生物體的絕大部分生命活動都遵循該法則。中心法則主要是圍繞DNA，RNA，蛋白質(zhì)來展開，通過這個過程實現(xiàn)遺傳信息的表達與傳遞。
那三個生物大分子之間是如果進行遺傳信息的傳遞的呢？首先，遺傳信息儲存在DNA中，通過轉(zhuǎn)錄將遺傳信息轉(zhuǎn)移到mRNA中，mRNA中含有密碼子，一個密碼子決定一個氨基酸，氨基酸最終組成蛋 白質(zhì)，這個過程也就是蛋白質(zhì)的翻譯過程。除了mRNA 以外，RNA還包括rRNA（它與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成核糖體，其功能是在mRNA的指導(dǎo)下將氨基酸合成為肽鏈），tRNA（tRNA能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準確地將它攜帶的氨基酸連結(jié)起來形成多肽鏈）。

圖一 中心法則

    今天我們以前來回顧一下真核生物基因表達的過程，這個過程涉及許多的名詞，在平時的科研生活中，很多同學(xué)對這些名詞也都很困惑，今天咱們就系統(tǒng)性的來復(fù)盤一下。

首先我們看一下基因的結(jié)構(gòu)：基因是染色體上具有控制生物性狀的DNA片段?；蛟诮Y(jié)構(gòu)上可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)，且非編碼區(qū)多于編碼區(qū)。在非編碼區(qū)，存在著許多的元件，它們雖不直接參與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但也對基因的表達起這重要的作用。

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圖二 基因結(jié)構(gòu)及作用元件

增強子是存在于DNA上的一段可以與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)段，增強子通過影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子和輔因子，從而激活或增強基因的轉(zhuǎn)錄，對真核基因的時空表達起著重要的調(diào)控作用。

    啟動子的主要作用是啟動和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子可以活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特性。它能夠指導(dǎo)全酶同模板正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，啟動基因轉(zhuǎn)錄。啟動子區(qū)一般包含兩個保守結(jié)構(gòu)域，分別是CAAT Box（控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率）和TATA Box（使轉(zhuǎn)錄精確地起始）。

    終止子是位于基因末端，給RNA聚合酶提供轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。

    沉默子：沉默子是一段能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的DNA序列，這種轉(zhuǎn)錄因子稱為阻遏蛋白。與增強子對DNA轉(zhuǎn)錄的加強作用相反，沉默子會抑制DNA的轉(zhuǎn)錄過程。

    非編碼區(qū)的這些元件統(tǒng)稱為順式作用元件包括啟動子，增強子，沉默子等，可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。

    說完了非編碼區(qū)，我們再來看看編碼區(qū)。編碼區(qū)主要由內(nèi)含子和外顯子組成，真核生物絕大部分是斷裂基因，內(nèi)含子和外顯子交替排布。

    外顯子是斷裂基因中的編碼序列，在后續(xù)mRNA的加工過程中被保存，是能編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

    內(nèi)含子是基因中無編碼功能的序列，也存在于pre-RNA中。

那么基因又是怎么成為直接參與生物體生命活動的蛋白質(zhì)的呢？這就涉及到基因的表達，今天我們主要講一下基因表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯這兩個過程。

    轉(zhuǎn)錄：是以DNA為模板，以4種NTP為原料，依據(jù)堿基配對規(guī)律，在DNA 指導(dǎo)（或依賴 DNA）的 RNA聚合酶催化下合成RNA的過程。真核生物的轉(zhuǎn)錄涉及許多的酶類以及蛋白因子，其中最重要的是轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶。

    轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors, TFs）指能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、TFIIJ。

    RNA聚合酶（RNA polymerase）是以一條DNA鏈或RNA為模板，三磷酸核糖核苷為底物，通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶，包括RNA聚合酶Ⅰ（合成rRNA），RNA聚合酶Ⅱ（合成mRNA），RNA聚合酶Ⅲ（合成tRNA），線粒體RNA聚合酶（合成線粒體RNA）。

    了解完轉(zhuǎn)錄的基本概念和所需的重要的蛋白質(zhì)和酶類后我們來看看轉(zhuǎn)錄的具體過程，轉(zhuǎn)錄分為3個過程，分別為轉(zhuǎn)錄起始，轉(zhuǎn)錄延長，轉(zhuǎn)錄終止。

    起始：RNA聚合酶對轉(zhuǎn)錄起始位點上游的DNA序列進行辨認，同時打開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，依賴轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動子形成復(fù)合物。

圖三 轉(zhuǎn)錄起始

延長：合成一段含有60-70個核苷酸的RNA分子后，RNA聚合酶根據(jù)堿基互補配對原則，從5’-3’方向逐個加入核糖核苷酸，進入轉(zhuǎn)錄延長期。

                                                                                         圖四 轉(zhuǎn)錄延長

終止：真核生物目前并沒有明確的轉(zhuǎn)錄終止信號，且3種RNA的合成終止方式不同。對于mRNA來說，在結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子的3’端常有一組共有序列AATAAAA，其下游還有GT序列，這些序列為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點，當RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出AAUAAA后，多聚腺苷酸特異因子（CPSF）能識別并與它結(jié)合，指導(dǎo)前mRNA的切割。在CPSF及切割活化因子（CstF）等因子的指導(dǎo)下，特異的內(nèi)切核酸酶在AAUAAA下游11-30個核苷酸出切斷RNA鏈， mRNA前體轉(zhuǎn)錄停止。

圖五 轉(zhuǎn)錄終止

 剛轉(zhuǎn)錄出來的mRNA又被稱為核不均一RNA（hnRNA），該RNA分子量非常大，且僅有10%的部分后期能轉(zhuǎn)變成成熟的RNA，其余部分在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中被降解。其結(jié)構(gòu)為：轉(zhuǎn)錄起始位點、外顯子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄終止位點。

    hnRNA又是如何成為成熟的mRNA的呢？這就涉及到mRNA前體物質(zhì)的加工過程，真核生物mRNA的加工一般包括：mRNA前體剪接，mRNA的修飾（5’加帽和3’多聚腺苷酸化），mRNA編輯。

   5’帽子結(jié)構(gòu)：合成一段RNA后，在鏈5’端加入鳥嘌呤核苷酸且在鳥嘌呤7號位氮上發(fā)生甲基化形成一個類似于帽子的結(jié)構(gòu)。帽子結(jié)構(gòu)的生理功能主要是為核糖體識別mRNA提供了信號，帽子結(jié)構(gòu)是核糖體識別mRNA所必須的；帽子結(jié)構(gòu)增加mRNA的穩(wěn)定性，保護mRNA免受5’外切核酸酶的降解；帽子結(jié)構(gòu)還能有助于成熟的mRNA的轉(zhuǎn)運，有助于前體RNA的正確拼接。

    3’多聚腺苷酸尾巴：與hnRNA的形成同步發(fā)生。先由核酸外切酶切去前體RNA的一些核苷酸，再加入polyA尾。多聚腺苷尾巴結(jié)構(gòu)的生理功能主要是提高RNA的穩(wěn)定性；增強RNA的翻譯效率。

    mRNA前體剪接：內(nèi)含子區(qū)段彎曲使外顯子靠近，然后在5’-GU/AG-3’處經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)脂反應(yīng)被剪去后外顯子進行拼接。外顯子不同的拼接方式會導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)錄本（轉(zhuǎn)錄本是由一條基因通過轉(zhuǎn)錄形成的一種或多種可供編碼蛋白質(zhì)的成熟的mRNA）的產(chǎn)生，這里就涉及到不同的轉(zhuǎn)錄本問題（對轉(zhuǎn)錄本有研究的小可愛評論區(qū)留言，討論）。

  mRNA 編輯：對外顯子進行加工，核苷酸的插入、刪除或轉(zhuǎn)換，從而改變RNA的序列使遺傳信息在mRNA上發(fā)生改變。

 
   經(jīng)過加過后前體RNA成為去掉內(nèi)含子，加上帽子結(jié)構(gòu)（GpppmG），加上polyA尾巴的成熟的可被翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA。加工過程如下圖。

                                                                                            圖六 前體RNA的加工成熟過程
 其結(jié)構(gòu)包括：5’帽子結(jié)構(gòu)、5’UTR區(qū)、CDS區(qū)、3’UTR區(qū)、polyA尾巴。那各個區(qū)段的含義又是如何，接下來我們一個個來解釋。

     5’UTR: 5’UTR區(qū)位于帽子結(jié)構(gòu)之后，指從mRNA的一端到編碼序列的起始密碼子之間的一段序列。該區(qū)域可能包起始始密碼子序列、RNA穩(wěn)定性元件和翻譯起始調(diào)控序列。5’UTR是翻譯起始的高度敏感區(qū)，其長度、二級結(jié)構(gòu)以及AUG的數(shù)量都會影響翻譯起始的效率。

    編碼區(qū)（CDS）：編碼區(qū)包括mRNA的一系列密碼子，它們會被翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。編碼區(qū)由起始密碼子（通常為AUG）和終止密碼子（例如UAA、UAG或UGA）標識。生物學(xué)中構(gòu)建的各種載體時所需的引物都是針對CDS來設(shè)計合成的。需要與ORF區(qū)分開來（開放閱讀框是從起始密碼子到種子密碼子中間的序列。CDS必定是一個ORF。但也可能包括很多ORF。反之，每個ORF不一定都是CDS）。

    3’UTR: 3’UTR區(qū)指從編碼序列的終止密碼子到mRNA鏈的末端之間的一段序列。該區(qū)域可能包含穩(wěn)定性元件、調(diào)控序列和終止子序列。

    接下來根據(jù)成熟信使RNA的核苷酸順序，以3個核苷酸組成一個遺傳密碼決定一個氨基酸的方式合成多肽，從而將mRNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)氨基酸序列。翻譯過程同樣涉及許多重要的酶、蛋白因子等。

    核糖體（Ribosome）是翻譯發(fā)生的場所，是翻譯過程中mRNA結(jié)合tRNA的空穴，有A位（氨酰tRNA進入核糖體后占據(jù)的位置）和P位（肽酰tRNA進入核糖體后占據(jù)的位置），核糖體包括大小兩個亞基。

    遺傳密碼（condon）是指mRNA分子上沿5'端到3'端方向，由起始密碼子AUG開始，每三個核苷酸組成的三聯(lián)體。它決定肽鏈上每一個氨基酸和各氨基酸的合成順序，以及蛋白質(zhì)合成的起始、延伸和終止，遺傳密碼子分為起始密碼子（AUG）和終止密碼子（UAG、UAA、UGA）。

    tRNA稱為轉(zhuǎn)運RNA，既能識別mRNA上的遺傳密碼，又能與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合。tRNA上含有反密碼子，可與密碼子配對，確保氨基酸的準確性。在翻譯過程中tRNA可以跟氨基酸結(jié)合成為氨酰-tRNA（位于核糖體的A位點上），也可以跟肽鏈結(jié)合成為肽酰-tRNA（位于核糖體的P位點上）。

   翻譯過程中也需要許多的因子來協(xié)助，包括起始因子（參與蛋白質(zhì)起始復(fù)合物的形成），延長因子（與氨酰-tRNA及GTP結(jié)合形成復(fù)合物，將氨酰-tRNA轉(zhuǎn)入A位點）和釋放因子（識別終止密碼子，終止肽鏈的合成釋放肽鏈）。

我們來了解下翻譯的基本過程。翻譯的基本過程也分為三個：翻譯起始、翻譯延長、翻譯終止。

    翻譯起始：翻譯過程主要的事件是起始氨酰-tRNA和mRNA分別與核蛋白體結(jié)合形成翻譯起始復(fù)合物。主要分為以下幾個步驟，首先核糖體大小亞基分離，核糖體40S小亞基與起始tRNA結(jié)合甲硫氨酸形成起始復(fù)合物前體；同時由于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物前體與AUG距離較遠，因此需要沿著mRNA鏈進行掃描，直至第一個AUG與tRNA的反密碼子配對，mRNA才準確定位在核糖體小亞基；核糖體大亞基結(jié)合；當起始復(fù)合物前體識別AUG后，核糖體小亞基在酶的作用下解離，核糖體大亞基結(jié)合，形成翻譯起始復(fù)合物。

    翻譯延長：主要事件是翻譯起始復(fù)合物形成后，核糖體從mRNA的5’端向3端移動，依據(jù)密碼子順序，從N端開始向C端合成多肽鏈。通常分為3個過程：進位（核糖體A位點上mRNA密碼子所規(guī)定的氨酰-tRNA進入核糖體A位點）；轉(zhuǎn)肽（氨酰-tRNA進位后，核糖體A位和P位上各結(jié)合了一個氨酰-tRNA，在酶的催化下，P位上的起始tRNA所攜帶的甲酰甲硫氨?；聂然cA位點的氨基酸的ɑ氨基形成肽鍵）；移位（在延長因子的催化下，GTP水解為移位提供能量，使mRNA與核糖體相對移位一個密碼子的距離，P位上的tRNA從P位釋放，A位上的肽酰-tRNA移到P位，mRNA分子上的第三個密碼子進到A位，為下一個氨酰-tRNA進位做好準備）。

    翻譯終止：當mRNA上出現(xiàn)終止密碼子后，氨酰-tRNA無法結(jié)合到A位，但釋放位子可以進入A位，此時核糖體上的肽鏈脫落，mRNA與核糖體分離，核糖體解離成大小亞基。

圖七 真核生物翻譯過程
至此，一個具有特定生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)合成完成。

    轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中涉及了非常多的元件，各自的序列也有不同的特點，那我們?nèi)粘Ｊ褂玫谋容^多的序列主要是以下幾種，我們先來了解一下這些序列平時的用途。

    啟動子序列：轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測；啟動子序列對比及保守性分析。

    CDS序列：不論是PCR還是QPCR，都是根據(jù)CDS序列來設(shè)計引物進行擴增以便進行后續(xù)的實驗。

    UTR區(qū)：對于研究一個基因的不同的剪切本有幫助（5’UTR區(qū)含有內(nèi)含子，內(nèi)含子最突出的作用是可以被選擇性剪接，進而產(chǎn)生不同功能的蛋白質(zhì)，并且無論內(nèi)含子處于在基因結(jié)構(gòu)的哪個位置，均可以調(diào)控基因的表達并涉及到每一步，包括mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、定位以及衰變等過程）。miRNA和靶基因的相互作用關(guān)系（雙熒光素酶實驗）。

    蛋白質(zhì)序列：我們可以將獲取的氨基酸序列用特定發(fā)的蛋白質(zhì)分析軟件進行分析，以便我們可以了解蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析；疏水性分析；跨膜區(qū)預(yù)測；信號肽預(yù)測；亞細胞定位預(yù)測；抗原性位點預(yù)測（相關(guān)網(wǎng)站如下：SCOP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫；PDB數(shù)據(jù)庫；UniProt數(shù)據(jù)庫；SWISS-PROT 數(shù)據(jù)庫；Pfam數(shù)據(jù)庫；STING數(shù)據(jù)庫。（對這部分內(nèi)容有感興趣的小伙伴可以留言討論）。

 mRNA序列：mRNA序列可用于動物實驗中siRNA, shRNA的設(shè)計與合成。

    了解了轉(zhuǎn)錄翻譯的具體過程以及每個過程產(chǎn)物最終的結(jié)構(gòu)，在日常的科研活動中經(jīng)常會遇到需要查找這些結(jié)構(gòu)的序列用于重組載體構(gòu)建或基因編輯以及基因調(diào)控等方面，那又怎么查找這些序列呢？這里我們就要用到一個功能非常強大的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫。
NCBI是美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information）的縮寫，它是一個國際上權(quán)威的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫。NCBI提供了包括GenBank（DNA序列數(shù)據(jù)庫）、PubMed（文獻檢索系統(tǒng)）、Nucleotide（核苷酸序列數(shù)據(jù)庫）、Genome（基因組數(shù)據(jù)庫）、Structure（結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫或稱分子模型數(shù)據(jù)庫）、Taxonomy（生物學(xué)門類數(shù)據(jù)庫）、PopSet等在內(nèi)的多個子庫，涵蓋了生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)的多個方面，是科研人員的重要資源。
網(wǎng)址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov及網(wǎng)頁截圖如下：

    Gene序列：打開NCBI，選擇Gene,輸入所需要查找的基因，點擊search, 點擊對應(yīng)的物種前的基因，找到NCBI Reference Sequence?？梢钥吹紾enomic，直接點擊Genomic下面的FASTA，可下載基因序列。

    mRNA和Protein序列：點擊NM開頭的轉(zhuǎn)錄本，跳轉(zhuǎn)進去就是mRNA，點擊Fasta，就可以下載mRNA序列；點擊NP就能得到mRNA對應(yīng)的蛋白序列。

點擊FASTA，即為mRNA序列：

下翻可見其CDS序列，點擊CDS，CDS序列被標記，可復(fù)制CDS序列。

同理蛋白質(zhì)序列可點擊該頁面的NP編號，點擊FASTA，即可得到蛋白序列。

啟動子序列：進入GeneBank，啟動子在mRNA的前1500-2000bp左右，因此在左側(cè)的區(qū)段設(shè)置往前1500bp，點擊Update View可得，序列前1500bp即為啟動子序列。

UTR序列：找到tool，序列查看，藍色為5’UTR和3’UTR, 紅色為CDS，綠色為內(nèi)含子。

好了，今天的文獻解讀就到這里，可以推給有需要的朋友或者同學(xué)噢~