有可能最全的PCR類型總結：36種PCR類型及其定義、原理和用途
2025-07-03 15:38:51
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
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1. 擴增片段長度多態(tài)性PCR（Amplified fragment length polymorphism PCR，AFLP PCR）這是一種基于PCR的技術，利用消化的DNA片段的一段選擇性擴增來為目標基因組生成獨特的指紋圖譜。該技術可以快速為任何生物體生成大量標記片段，而無需事先了解基因組序列。AFLP PCR使用限制性內切酶消化基因組DNA，并允許接頭連接到片段的粘性末端。然后選擇一部分限制性片段，使用與銜接子序列互補的引物進行擴增。擴增的序列在瓊脂糖凝膠電泳變性時分離和可視化。AFLP PCR用于多種應用，如評估物種內或密切相關物種之間的遺傳多樣性，推斷種群水平的系統(tǒng)發(fā)育和生物地理模式，生成遺傳圖譜和確定品種之間的相關性。2. 等位基因特異性PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）AS-PCR是一種基于等位基因特異性引物的技術，可用于分析單核苷酸多態(tài)性。AS-PCR也稱為（amplification refractory mutation system）ARMS-PCR，對應于對兩個不同等位基因使用兩種不同的引物。一種是對正常PCR耐熱的突變引物組，另一種是對突變PCR反應耐熱的正常引物組。這些引物的3'末端經過修飾，使得一組引物可以擴增正常等位基因，而其他引物可以擴增突變等位基因。這種錯配允許引物擴增單個等位基因。廣泛應用于鐮狀細胞性貧血、地中海貧血等單基因點突變檢測。也用于ABO血型基因型的直接測定。Alu PCR是一種快速簡便的DNA指紋圖譜技術，基于對Alu重復元件包圍的許多基因組位點的同步分析。Alu元件是短段DNA，最初以黃體節(jié)桿菌（Alu）限制性核酸內切酶的作用為特征。Alu元件是最豐富的轉座因子之一，在整個人類基因組中都有發(fā)現，它們在進化中發(fā)揮作用，并已被用作遺傳標記在Alu PCR中，使用與這些序列互補的兩個熒光染料標記的引物進行 PCR，然后通過Alu插入已用于多種遺傳性人類疾病和各種形式的癌癥。因此，這種PCR在檢測這些疾病和突變中起著至關重要的作用。組裝PCR是一種從多個較短片段組組裝出大DNA寡核苷酸的方法。在PCR中，使用的寡核苷酸大小為18個堿基對，而在組裝中，使用高達50bp的PCR長度以確保正確雜交。在PCR循環(huán)中，寡核苷酸與互補片段結合，然后被聚合酶填充。因此，該PCR的每個循環(huán)都會隨機增加各種片段的長度，具體取決于哪些寡核苷酸相互找到。組裝PCR用于提高所需蛋白質的產量，也可用于產生大量RNA用于結構或生化研究。5. 非對稱PCR（Asymmetric PCR）非對稱PCR是PCR的一種變體，用于優(yōu)先擴增原始DNA的一條鏈而不是另一條鏈。非對稱PCR與常規(guī)PCR的不同之處在于所選鏈的引物量過大。隨著非對稱PCR的進行，較低濃度的限制引物被定量摻入新合成的雙鏈DNA中并用完。因此，在耗盡限制性引物后，從過量引物形成靶向單DNA鏈的線性合成。當只需要擴增兩條互補鏈中的一條時，例如在測序和雜交探測中，它非常有用。基于低溫變性的冷PCR是一種新型PCR形式，可選擇性地從野生型和含突變體（或包含變體）序列的混合物中擴增低豐度DNA變體，而不管突變類型或在擴增子上的位置如何。該方法基于對臨界溫度的修改，在該溫度下，含突變的DNA優(yōu)先于野生型DNA退火。變性后有一個中間退火過程，允許野生型和突變等位基因雜交。這種錯配會略微改變dsDNA的退火溫度。這些異源雙鏈體會熔化并用作模板。因此，更大比例的次要變異DNA將被擴增并可用于后續(xù)輪次的PCR。PCR在腫瘤標本突變的檢測中起著至關重要的作用，尤其是在異質性腫瘤和體液中。該PCR還有助于評估手術或化療后的殘留病灶以及疾病分期和分子分析，以便為個體患者提供預后或定制治療。菌落PCR是一種通過設計插入的DNA特異性引物來鑒定插入質粒中的目標DNA的方法。含有質粒的細菌菌落可以使用兩組引物直接擴增。第一組是擴增插入序列的插入特異性引物，另一組是載體特異性側翼引物，用于擴增插入的DNA以外的質粒DNA。取細菌菌落并直接加入到含有所有其他PCR試劑的預混液中。菌落PCR的主要應用是鑒定正確的連接以及將插入的 DNA 插入細菌以及酵母質粒中。是一種用于 DNA 體外復制的技術，可在短短幾個小時內將 “目標” DNA 序列選擇性擴增數百萬倍。PCR能夠使用DNA聚合酶合成特異性DNA片段，該酶參與細胞遺傳物質的復制。這種酶合成 DNA的互補序列，因為一個小片段（引物）連接到選擇開始合成的特定位點的一條DNA 鏈。引物限制了要復制的序列，結果是擴增了數十億個拷貝的特定 DNA 序列。常規(guī)PCR應用于選擇性DNA分離、DNA擴增和定量、醫(yī)學和診斷方法、傳染病診斷、法醫(yī)研究和研究領域。9. 數字PCR（Digital PCR，dPCR）數字PCR （dPCR） 是一種定量PCR技術，為測量樣品中存在的DNA或RNA量提供了一種靈敏有效的方法。對于dPCR，在擴增步驟之前，將初始樣品混合物分成大量單獨的孔，使每個孔中存在或不存在靶序列。根據擴增反應孔中是否存在熒光，計算原始樣品中存在的靶標的絕對數量。具有熒光信號的孔被視為陽性，評分為“1”，而沒有熒光信號的孔為陰性，評分為“0”。然后通過泊松統(tǒng)計分析確定初始樣品中存在的目標序列的濃度。dPCR用于測定各種臨床標本中DNA和RNA病毒、細菌和寄生蟲的總數，主要是在沒有經過充分校準的標準品的情況下。10. 快速循環(huán)PCR（Fast cycling PCR）快速循環(huán)PCR是一種基于PCR的技術，可擴增特異性PCR產物，并顯著縮短循環(huán)時間。該過程的原理與常規(guī)PCR相同，唯一的區(qū)別是擴增時間。該PCR中使用的緩沖液提高了Taq DNA聚合酶對短單鏈DNA片段的親和力，將引物成功退火所需的時間縮短至僅5秒?？焖傺h(huán)PCR 對于需要快速循環(huán)的過程至關重要，也有助于快速診斷疾病和突變。11. 高保真PCR（High Fidelity PCR）高保真PCR是一種經過修飾的PCR方法，它利用錯誤率低的DNA聚合酶，可在目標DNA的復制中實現高度的準確性。在擴增過程中，這種酶對正確的三磷酸核苷具有顯著的結合親和力。在聚合酶活性位點結合不正確的情況下，由于活性位點復合物的結構，摻入速度會減慢。高保真擴增對于結果取決于正確DNA序列的實驗（如克隆、SNP分析、NGS應用）至關重要。12. 高分辨率熔解PCR（High-Resolution Melt PCR，HRM PCR）熱啟動 PCR 是常規(guī)聚合酶鏈式反應（PCR）的一種改進形式，可減少因室溫下非特異性 DNA 擴增而產生的非目標產物，同時降低引物二聚體的形成概率。與其他基因分型技術（如測序和Taqman SNP分型）相比，它具有極大的成本效益。這使其成為大規(guī)模基因分型項目的理想選擇。它快速而強大，因此能夠快速準確地對大量樣品進行基因分型。通過高質量的HRM檢測，非遺傳學家可以在任何可以使用支持HRM的實時熒光定量 PCR 機器的實驗室中進行強大的基因分型。13. 熱啟動PCR（Hot start PCR）有可能最全的PCR類型總結：36種PCR類型及其定義、原理和用途。熱啟動PCR的基本原理是從反應混合物中分離一種或多種試劑，直到混合物在加熱時達到變性溫度。熱啟動PCR可顯著降低非特異性結合、引物二聚體的形成，并且通常會提高產物產量。它還需要更少的工作量并降低污染風險。原位PCR是一種有效的方法，可檢測冷凍或石蠟包埋的細胞或組織切片中微量的稀有核酸序列，以將這些序列在細胞內區(qū)室化。該方法涉及保留細胞形態(tài)的組織固定，然后用蛋白水解酶處理，為PCR試劑提供作用于目標DNA的入口。靶序列通過試劑擴增，然后通過標準免疫細胞化學方案進行檢測。原位PCR適用于傳染病的診斷、DNA的定量、微量DNA的檢測，并廣泛用于器官發(fā)生和胚胎發(fā)生的研究。15. 序列間特異性（Intersequence specific PCR，ISS PCR）序列間特異性PCR（或ISSR-PCR）是一種DNA指紋圖譜分析方法，它使用從整個基因組中重復的特定片段中選擇的引物來產生獨特的指紋圖譜。該技術使用微衛(wèi)星（通常為 16-25 bp 長）作為靶向多個基因組位點的單個引物PCR反應中的引物，主要擴增不同大小的SSR間序列。ISSR PCR可用于基因組指紋圖譜、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析、基因組圖譜和基因標記。 是聚合酶鏈反應的眾多變體之一，用于在僅知道一個序列時擴增DNA。常規(guī)PCR需要與靶 DNA的兩個末端互補的引物，但反向PCR允許進行擴增，即使只有一個序列可用，也可以從中設計引物。反向PCR涉及一系列限制性酶切，然后進行連接，這會產生一個環(huán)狀片段，然后可以通過已知序列的單個片段引發(fā)PCR。然后，與其他PCR過程一樣，DNA被溫度敏感的 DNA聚合酶擴增。反向PCR對于測定宿主DNA中各種轉座子和逆轉錄病毒的插入位置特別有用。17. 指數后線性PCR(Linear-After-The-Exponential PCR，LATE PCR）LATE PCR是非對稱PCR 的改進，它使用比過量引物熔解溫度更高的限制性引物，當限制性引物濃度在反應中期降低時保持反應效率。LATE-PCR從指數期開始，其中擴增效率與常規(guī) PCR相似。一旦限制性引物耗盡，反應突然切換到線性擴增，單鏈產物繼續(xù)進行許多額外的熱循環(huán)。18. 連接介導的PCR（Ligation mediated PCR）連接介導的PCR是常規(guī)PCR的一種改進形式，最初只需知道一端，然后通過連接獨特的DNA 接頭添加第二端即可實現。連接介導的PCR利用稱為“接頭”的小DNA片段，這些片段最初連接到目標DNA的片段上。然后使用旨在與接頭序列結合的PCR引物來擴增靶片段。該方法用于 DNA 測序、基因組行走和DNA足跡。19. 長范圍PCR（Long-Range PCR）長范圍PCR是一種擴增通常無法使用常規(guī)PCR方法或試劑擴增的較長DNA的方法。通過使用具有增強DNA結合的修飾高效聚合酶，可以實現長片段的高效合成和準確擴增。這種方法允許在更短的時間內擴增更多擴展的靶標，并有效利用資源。20. 甲基化特異性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）MSP是一種檢測和分析CpG島中DNA甲基化模式的方法。為了進行MSP，通過兩個引物對修飾DNA，并使用兩個引物對進行PCR，這兩個引物對分別是可檢測的甲基化DNA和未甲基化 DNA。DNA用亞硫酸氫鹽處理以將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，然后用特異性引物選擇性擴增甲基化序列甲基化模式的檢測是必不可少的，因為啟動子中CpG二核苷酸的過度甲基化會抑制基因表達。21. 小引物PCR（Miniprimer PCR）一種使用工程聚合酶和10個核苷酸“小引物”的新PCR方法。發(fā)現該方法揭示了標準引物無法檢測到的新型16SrRNA基因序列。小引物PCR使用熱穩(wěn)定聚合酶，該酶可以從短引物（9 或 10 個核苷酸）延伸而來。該方法允許PCR靶向較小的引物結合區(qū)域，并用于擴增高度保守的 DNA序列，例如16S（或真核18S）rRNA基因。22. 多重 PCR（Multiplex PCR）多重PCR是一種常見的分子生物學技術，用于在單次PCR檢測運行中擴增多個靶標。在多重 PCR中，多重引物和溫度介導的DNA聚合酶用于在熱循環(huán)儀中擴增DNA。必須優(yōu)化為多重 PCR設計的所有引物對，以便在PCR過程中所有引物對的相同退火溫度都是最佳的。當一次靶向多個序列時，可以從單次測試運行中生成更多信息，否則將需要大量的試劑以及大量的時間和精力來執(zhí)行。該技術已應用于基因分型、突變和多態(tài)性分析、微衛(wèi)星STR分析、病原體或轉基因生物檢測等多個領域。在診斷實驗室中，多重PCR可用于檢測導致相同類型疾病的不同微生物。23. 納米粒子輔助 PCR （Nanoparticle-Assisted PCR，nanoPCR）納米顆粒相關PCR包括小分子物質，這些物質由增強反應的特定物理性質組成。涉及金納米顆粒的理論之一指出，這些顆粒吸附了一些聚合酶并管理系統(tǒng)中剩余的聚合酶量，這對于增強反應的特異性可能是必要的。另一種理論解釋說，它們吸附引物對并降低完美配對和錯配對引物之間形成雙鏈體時的熔解溫度，這導致反應特異性的增加。納米顆粒相關PCR具有高靈敏度、高特異性、高選擇性等優(yōu)點，已廣泛應用于病毒檢測和基因測序。巢式PCR是對PCR技術的一種有用的修改，其中在兩組引物的幫助下通過阻止非特異性結合來增強反應的特異性。第一組引物在我們的靶DNA外部結合并擴增較大的片段，而另一組引物在靶位點特異性結合。在第二輪擴增中，第二組引物僅擴增靶DNA。巢式PCR是系統(tǒng)發(fā)育研究和檢測不同病原體的有用方法。該技術具有更高的靈敏度；因此，即使樣品中含有較低的 DNA，也可以被擴增，這在傳統(tǒng)的PCR技術中是不可行的。25. 重疊延伸PCR （Overlap extension PCR，OE-PCR）這種方法也稱為“通過重疊擴展進行拼接”或 SOEING。重疊延伸PCR是一種有價值的技術，通常用于克隆大型復雜片段、對克隆基因進行編輯或將兩個基因元件融合在一起。它從較短的 DNA片段中產生長DNA片段。它用于高效的基因克隆和多位點定向大片段的插入、缺失和替換。它被證明可用于定點誘變、嵌合分子的產生，甚至通過將較小的片段剪接在一起來克隆大基因片段。26. 定量PCR/實時PCR（Quantitative PCR/Real-Time PCR，qPCR）定量PCR（qPCR），也稱為實時PCR或實時定量PCR，是一種基于PCR的技術，它將目標 DNA序列的擴增與反應中該DNA種類濃度的定量相結合。傳統(tǒng)PCR是一個耗時的過程，其中 PCR產物通過凝膠電泳進行分析。qPCR通過在指數期提供產物的實時檢測來促進分析。實時熒光定量PCR的原理取決于熒光染料的使用。使用熒光染料或熒光標記的寡核苷酸對樣品中存在的核酸濃度進行定量。qPCR應用于病原體的基因分型和定量、microRNA分析、癌癥檢測、微生物載量檢測和轉基因生物檢測。27. 基于重復序列的PCR（Repetitive sequence-based PCR，rep-PCR）基于重復序列的PCR（rep-PCR）是一種改進的PCR技術，它使用靶向散布在整個細菌基因組中的非編碼重復序列的引物。這種非編碼、重復序列塊可以作為寡核苷酸探針的多個遺傳靶標，從而能夠為單個細菌菌株生成獨特的DNA圖譜或指紋圖譜。rep-PCR的主要應用是不同細菌的分子菌株分型。它還用于各種病原體的流行病學鑒別。28. 逆轉錄PCR（Reverse Transcriptase PCR，RT-PCR）逆轉錄PCR（RT-PCR）是傳統(tǒng)PCR的改進，其中RNA分子首先轉化為互補DNA（cDNA） 分子，然后可以通過PCR擴增。在RT-PCR中，首先使用逆轉錄酶將RNA模板轉化為互補 DNA（cDNA）。然后，cDNA充當使用PCR進行指數擴增的模板。RT-PCR可以在單管中進行，也可以在不同的試管中作為兩個步驟進行。一步法更有效，污染和摻入變異的機會更少。RT-PCR用于研究方法、基因插入、遺傳病診斷和癌癥檢測。29. 逆轉錄定量/實時PCR（Reverse-Transcriptase Quantitative/Real-Time PCR ，RT-qPCR）RT-PCR與qPCR的結合。這允許在擴增后實時定量DNA。30. 核糖核酸酶H依賴性PCR（RNase H-dependent PCR）在RNase H依賴性PCR中，引物的3'端包含一個可移除的擴增塊。封閉的引物只能根據 RNase Henzyme在與互補靶序列雜交過程中的切割活性進行擴增。RNase H酶在低溫下具有非常低的酶活性，無需對DNA聚合酶進行任何修飾即可實現熱啟動。同樣，當RNA殘基附近存在錯配時，酶的切割效率會降低。因此，在RNase H酶的活性下，非特異性結合和引物二聚體形成減少，從而實現有效雜交。31. 單特異性引物PCR（Single Specific Primer PCR，SSP-PCR）單特異性引物PCR是一種基于PCR的技術，允許擴增只有一段部分序列信息的基因。它允許基因組從已知區(qū)域單向行走到染色體的未知區(qū)域。這允許擴增雙鏈DNA，即使序列信息僅在一端可用。允許擴增只有部分序列信息可用的基因，并允許基因組從已知區(qū)域單向行走到染色體的未知區(qū)域。32. 固相PCR（Solid Phase PCR，SP-PCR） 是一種獨特的PCR技術，允許在固體支持物上擴增靶核酸，其中一個或兩個引物固定在表面。引物的空間分離最大限度地減少了顯著不良的引物相互作用，從而防止了引物二聚體的形成，并允許更高的多重擴增。這種新方法的中心思想是將引物的5′端附著在表面上，而不是讓引物在散裝溶液中自由擴散?？梢栽诒砻娌东@自由擴散的 DNA 靶標，然后由聚合酶復制?？截惐３指街诒砻?，而初始 DNA 分子在退火步驟后返回溶液。附著拷貝的自由端與與其序列互補的引物（附著在表面）雜交，擴增過程可以開始。自殺式PCR是最常用的研究，其中避免假陽性和確保擴增片段的特異性是最高優(yōu)先級。該方法只需要在PCR中使用一次任何引物組合，這不應該用于任何陽性對照PCR反應。這些引物應始終靶向在使用此特定引物或任何其他引物組之前從未擴增過的基因組區(qū)域。這種安排可確保實驗室中不存在來自先前PCR反應的污染DNA，否則可能會產生假陽性。自殺PCR用于古遺傳學研究，其中涉及檢查古代生物遺骸中保存的遺傳物質。34. 熱不對稱交錯PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）TAIL-PCR是回收與已知序列相鄰的DNA片段的強大工具。TAIL–PCR在連續(xù)反應中使用三個嵌套引物和一個具有低熔解溫度的任意簡并引物，因此可以熱控制特異性和非特異性產物的相對擴增頻率。該方法高度準確，因此可以直接對未純化的TAIL-PCR 產物進行測序。它還允許克隆全長功能基因。
35. 降落PCR（Touch down PCR）降落PCR 是PCR的一種修飾，其中初始退火溫度高于引物的最佳Tm，并在隨后的循環(huán)中逐漸降低，直到達到 Tm 溫度或“降落溫度”。降落PCR提高了較高溫度下反應的特異性，并通過降低退火溫度提高了接近尾聲的效率。36. 可變串聯重復序列PCR（Variable Number of Tandem Repeats PCR，VNTR-PCR）它們是法醫(yī)學個體化的重要標志。在VNTR-PCR中，擴增的片段在一個物種內幾乎沒有變化，但確實顯示出物種之間的差異。它可以通過PCR從極少量的基因組脫氧核糖核酸（DNA）中成功擴增。在基因分型工具中，基于VNTR-PCR分析代表了一種很有前途的結核分型方法。
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